儿童白癜风饮食 https://m-mip.39.net/disease/mipso_6028162.html文章转自《医学实验动物》，是10月14日转载的《研究COPD用什么动物》一文的第二部分。具体介绍了造模方法。慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydisease,COPD）以不完全可逆的持续性进行性气流受限为特点,常伴随急性加重及严重并发症。建立标准化且切合临床COPD特征的动物模型对探究其发生发展、病理生理、形态功能学改变及新的治疗途径具有重大意义。上期我们介绍了建立COPD模型实验动物的选择，这期将介绍如何建立COPD动物模型及其评价方法，注意事项。建立COPD体外模型COPD体外模型可在受控环境中研究特定的生理病理过程。COPD涉及多个系统,要了解疾病的发生发展,需研究各系统的细胞,以更准确地模拟个体体内环境。目前常用的体外模型有保留肺结构和组织特性的离体肺切片,允许细胞外基质和组织因子参与的灌注模型,三维（3D）类器官模型及涉及未分化的支气管上皮细胞模型。使用体外培养细胞需要注意细胞从炎性细胞外基质和环境中移出是可能会发生一些改变从而影响研究结果,导致临床应用价值欠佳。尽管体外/离体方法具有许多优势,但由于人体组织/细胞的变化,有限的可用性及实验室间的差异,使可重复性受到限制。但随着3D打印技术的不断发展和对干细胞生物学的深入研究,建立标准化实验室人体组织的前景可观。建立COPD动物模型COPD的病因、发病机制及病理改变复杂,用于研究COPD的动物模型应符合人类COPD诱导刺激的一系列相似的解剖和生理病理反应,从分子,细胞,器官和个体等多个层面展开,在建模中选择符合致病因素的诱导条件建立COPD模型。包括以下几个方面。诱导因素诱导方法单因素诱导模型1.吸入有害气体/细颗粒物2.气道滴注弹性蛋白酶3.气管内注入脂多糖4.细菌/病毒感染5.基因控制模型6.植入他莫西芬7.免疫相关型模型复合模型1.烟雾＋LPS2.烟雾＋细菌/病毒感染3.烟雾＋PM2.54.烟雾＋弹性蛋白酶5.弹性蛋白酶＋脂多糖6.氯化钙＋山黎豆类制品等1单因素诱导模型1.1吸入有害气体/细颗粒物目前常用的有害气体/细颗粒物为烟雾,PM2.5,二氧化硫,二氧化氮,臭氧等。由于吸烟和空气污染为COPD发生的重要危险因素,所以烟雾暴露(CS)和PM2.5在建模中较常使用。吸入有害气体及细颗粒物的效应随暴露时间的长短,频率,次数,暴露类型(局部烟熏,全身暴露,腹腔注射)和烟雾产生方式(吹气或吸气行为产生的主流烟雾,卷烟燃烧产生的侧流烟雾)的不同而差异较大。Fr?hlich等发现全身或经鼻系统的烟雾暴露方法的差异为诱导COPD表型变异的可能原因。Zhao等将C57BL/6J小鼠暴露于PM2.周后出现肺功能下降,气肿性病变和气道炎症,造模成功。同时CS暴露后肺气肿表型的发生发展有种间差异,一般单纯烟雾暴露2个月即出现早期COPD肺部改变,6个月出现典型的COPD肺部表现。需要注意的是某些物种(例如鼠)对CS诱导的嗜中性炎症和肺损害具一定的抵抗力,这种抵抗在中断CS暴露后就会停止甚至恢复。因此,单纯CS暴露的小鼠模型无法符合临床COPD的复杂性及严重性特点,适用于研究早期COPD疾病特征,需将结合多个不同的模型进行对比分析。1.2气道滴注弹性蛋白酶目前常用的蛋白酶包括猪胰蛋白酶,木瓜弹性蛋白酶,人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶,基质金属蛋白酶。弹性蛋白酶可诱导大鼠产生肺气肿,该模型的优点在于经气管内滴注可免受血液中弹性蛋白酶抑制因子的灭活,单剂量弹性蛋白酶即可导致肺泡壁结构短期丧失并可诱导并维持炎症反应的发生。但弹性蛋白酶的给药窗口狭窄,低于推荐剂量浓度不足以引起肺部结构发生变化,而高于阈值水平的浓度会导致动物严重肺出血和死亡,研究表明弹性蛋白酶诱导啮齿类动物出现COPD病理改变需21～45d；Longhini等制备了使用抗弹性蛋白自身免疫性鼠模型引起的肺气肿,可用于检查免疫耐受在COPD中的作用,增加基于弹性蛋白酶模型的临床相关性。弹性蛋白酶不但破坏肺泡间隔的弹性纤维,同时也引起气管壁及血管壁等组织的破坏,这与人类COPD肺气肿的病理表现接近。1.3气管内注入脂多糖脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,存在于空气污染和有机粉尘中。LPS暴露会引起嗜中性粒细胞和巨噬细胞大量聚集,导致肺部炎症的发生,长期暴露会引起肺部结构发生变化,这种变化在LPS接触停止后仍会持续。研究表明LPS鼻内滴注的最佳时间为72h,28d即可形成COPD模型。脂多糖动物模型存在肺功能下降、肺气肿、小气道重塑、肺部炎症等现象。DeOliveira等利用LPS成功制备了急性肺气肿加重模型以进行COPD急性加重期相关研究。与其他模型相比,使用LPS诱导产生炎症和纤维化模型以实现COPD的病理学特征所需时间相对较短且与人类COPD的临床特点接近。1.4细菌/病毒感染感染是发生COPD急性加重最重要的诱因,可导致病情进展及病死率增加。目前常用的细菌/病毒有铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯杆菌,流感嗜血杆菌,肺炎链球菌,大肠杆菌,流感病毒,鼻病毒,人免疫缺陷病毒(HIV)等。此模型适用于研究细菌导致肺组织损伤的机理,但实践中要注意选取细菌的种类及控制细菌的数量。单纯应用细菌/病毒建立COPD模型的情况较少,多与其他因素联合使用建立COPD动物模型。1.5基因控制模型COPD具有遗传和环境易感性,遗传性α1-抗胰蛋白酶缺乏(AATD)尽管只占很小一部分,却很好的解释了遗传与环境的相互作用致使个体倾向于发生COPD,不过尚不明确这些基因究竟是COPD发病的基因或仅仅是致病基因的标记。基因调控模型主要包括自然变异的COPD模型,如紧皮、苍白、斑点型小鼠。转基因COPD模型如将删除肺上皮神经纤毛蛋白1(Nrp1)的基因缺失小鼠暴露于烟雾中周制备的Nrp1基因缺失型COPD动物模型,发现上皮Nrp1在维持正常肺泡结构中的作用,可用于研究Nrp1表达失调在慢阻肺发展中的机制。Nakashima等通过诱导气道上皮Na+通道b亚基(bENaC-Tg老鼠)建立了COPD模型,以探索C57BL/6J基因型小鼠与bENaC-Tg鼠表现出的弥漫型肺气肿模型稳定表达炎性和衰老样标记物的差别。现已制备的COPD模型包括α1-抗胰蛋白酶、TGF-β、人趋化因子受体6、Klotho基因、胚胎干细胞诱导突变和肺表面活性物质D等敲除鼠。COPD基因改造模型获得的动物模型具有遗传稳定性和重复性,允许从细胞分子易感性水平上来分析特定性的调控作用及其功能,对于COPD的预防和治疗提供重要的工具,但其不能产生人类COPD的几种特定表现,因而限制了其转化应用价值。1.6植入他莫西芬一直以来,国内外关于性别与COPD易感性及急性加重是否相关存在很大争议。相关研究表明:与吸烟男性相比,40～50女性吸烟者的肺功能下降快于男性吸烟者,并且COPD风险增加了50%。Tam等将雄性,雌性和卵巢切除的C57BL/6小鼠先烟雾暴露6月,然后给雌性小鼠植入他莫昔芬,暴露2周后进行第二次干预,每只小鼠再次植入75mg他莫昔芬颗粒继续暴露4周后成功制备雌激素缺乏的COPD模型,证明了雌激素可能参与了烟雾暴露雌性小鼠中独特的氧化剂/TGFβ信号转导轴失调。为寻找雌激素信号传导级联反应下游的治疗靶点提供实验基础,用于探索女性COPD的干预治疗提供了新的理论指导。1.7免疫相关型模型吸烟一直被认为是发生COPD最重要的危险因素,但戒烟2年后气道炎症仍在持续,该现象与自身免疫性疾病的特征相似。相关研究表明CS暴露可显着降低患者SP-D的肺泡水平,尼古丁可导致人气道上皮细胞中SP-D水平降低。Sorensen等通过诱导上皮Na+通道b亚基的气道特异性过表达的小鼠(bENaC-Tg小鼠)3周建立了SP-D基因敲除的COPD小鼠,为研究肺部炎症和先天免疫以及进行肺表面活性物质稳态研究提供了建模基础。Hirota等研究了由气道上皮NLRP3炎性小体介导的PM10暴露的先天性和适应性免疫反应模型,证明了肺NLRP3炎性体在介导PM10暴露相关的先天性而非适应性免疫反应中的重要性,用于研究PM10暴露加剧气道疾病的机制。2．复合因素单一造模方法难以模拟出符合临床的COPD模型,并且耗时较长。为了尽可能全面真实地模拟COPD的发病过程及病理特点,多数研究者倾向于采用复合因素构建COPD动物模型。近年来常用的复合因素造模方式包括:烟雾+LPS,烟雾+细菌/病毒感染,烟雾+PM2.5,烟雾+弹性蛋白酶,弹性蛋白酶+脂多糖,氯化钙+山黎豆类制品等联合方式。舒家泽等通过烟草烟雾口鼻暴露联合脂多糖的方法成功建立慢性阻塞性肺疾病及相关肺动脉高压(COPD.PH)的小鼠模型,可用于研究减轻肺动脉高压的治疗策略,并提示4周即可形成COPD大鼠模型。Shu等利用机动车尾气(MVE)和气管内滴注脂多糖(LPS)13周成功建立了COPD动物模型,并出现了心室和血管病理变化。Mebratu将大鼠暴露于CS2个月后感染甲型流感病毒(IAV)/呼吸道合胞病毒(RSV)/病毒衍生物肌苷聚胞苷酸[poly(I:C)]以及联合铜绿假单胞菌+肺炎链球菌及流感嗜血杆菌建立了COPD细菌/病毒感染模型,表明CS引起的炎症反应和气肿改变的程度取决于病毒感染的类型。这些动物模型可能有助于研究不同病毒加剧CS诱导的炎症和肺气肿的机制。Wang等将C57BL/6基因型小鼠联合暴露于PM2.5和CS/CSE40周成功制备COPD模型,提出在COPD的背景下,PM2.5可加剧CS/CSE诱导的炎症。Geraghty等使用EcoHIV野生型小鼠2个月诱导建立了COPD模型,再现了人类HIV相关COPD的几种病理生理特征,可用于确定HIV相关COPD的关键参数并测试该疾病的未来疗法。陈敏等通过烟熏+间歇低氧8周成功构建大鼠COPD-OSAHS重叠综合征模型,为开展OS基础研究提供了参考。复合因素建立的COPD模型,可从多方面探究疾病的发生发展及病理生理过程,使建立COPD合并症模型成为可能。需要注意的是复合因素建模对动物的耐受性要求较高,在选择造模动物时需全面考虑。COPD模型的评估目前用于判断COPD模型是否造模成功的评估内容主要包括:动物行为学改变,如观察皮毛光泽度、活动情况、反应灵敏度、精神状况、进食进水量、呼吸状况、体重变化、死亡情况、呼吸道变化等,由于影响因素较多,缺乏统一的评分标准,评估时多与其他方法联合使用。测定肺功能(有创和无创测定法),其中无创体描测定可在生理状态下观察药物等治疗方法对肺功能的影响,脉冲振荡技术可通过测定呼吸道阻力、黏性阻力,弹性阻力,惯性阻力等参数分析出是否存在气道阻塞、部位及程度;同时还有肺动脉仪量化气道内压、肺阻力、肺顺应性等。肺功能测定对于确定疾病模型是否出现气流受限具有重要意义,且操作方便,可重复性良好,在COPD模型的评价中应用前景广阔。肺部切片病理学改变可确定气道及肺实质的病理变化是否符合COPD的典型改变,包括:中央气道黏液腺增大,炎症细胞浸润;外周气道损伤,胶原蛋白沉积及修复;纤毛倒伏、变短、粘连,脱落;气道平滑肌增厚;肺泡扩张,肺泡壁变薄,肺大泡形成,肺泡数目显著减少等,此方法简便、直观、易操作,在哮喘、COPD、肺纤维化等多种肺部疾病的研究中具有重要参考意义,能够客观地反映病理特征及严重程度,应用较多。肺泡灌洗液分析白细胞和中性粒细胞,血清IgE,BLAF的总细胞浓度计数与分类计数是动物实验中常用的观察指标之一且准确性高;免疫组化检测呼吸道中的细胞因子(IL-8,TNF-α,IFN-γTGF-β)和趋化因子(CCL-2,CXCL1,CXCL9,CXCL10和CXCL11等,标本易获取,可操作性强,应用广泛。Marcos等提出了平均线性截距和等效直径以量化组织学切片中的气肿性病变相关的区域,使用贝叶斯方法得出新型气肿严重程度指数(SI)及X射线显微断层扫描(micro-CT)评估肺气肿等,两种方法均可实现对肺气肿的范围及分布进行定量分析,并可在肺功能正常的早期阶段发现肺气肿,有助于COPD早期诊断与治疗。Micro-CT分辨率达到微米级别,可无创、清晰的观测样本内部显微结构,对肺部改变非常灵敏,可用于无创动态监测肺部病理变化,展示疾病动态过程。建立COPD模型需要注意的问题COPD发病率、致死率高,诊断率低并呈慢性迁延,其病因、发病机制及病理改变复杂,所以在设计模型时应充分考虑动物品种及各诱导因素的优缺点,最大化符合临床,优化从分子水平、药物化学评估、体外测试、预测性动物模型到最终人类临床试验的级联测试,选择最适用于研究目的的造模方法。临床实际中COPD的发生发展及形态功能学改变复杂,常伴随急性加重及合并症,单一的造模方法难以模拟出符合临床实际的COPD模型且耗时较长,目前多倾向于采用复合因素构建COPD动物模型,针对不同的研究目的,采用2～3个诱导因素进行造模,缩短造模时间,深入研究COPD及其合并症的相关问题。一直以来,小鼠和大鼠因其造模价格相对便宜、饲养方便、品种丰富等各方面优点,是多数研究者造模的优先选择,但同时也须考虑物种之间的关联性及可比性,使实验结果的临床推广性更佳,越来越多的学者选择中型动物及非灵长类动物作为造模对象。因造模动物、诱导因素、诱导剂量及方式等不同,造模所需时间也有所差别,评估造模是否成功需根据造模目的,结合功能学、结构学及肺组织中细胞数目计数等方法综合评估,在模型评估中尽量采用评估标准明确,主观性小的评估方法,保证评估结果的准确性及可重复性。目前COPD动物模型的主要限制一方面体现在不能再现患者在临床环境中实际发生的情况及相关合并症,单一的COPD模型没有COPD疾病特征的广度,特别是疾病后期。随着对COPD动物模型研究的不断深入,越来越多贴近临床实际的COPD模型被建立及完善,并应用于研究其发病机制及新的治疗途径和靶点。建模另一个关键是急性加重,尽管感染(尤其是病毒感染)是病情加重最常见的病因,但各患者之间具有COPD易感性,发作频率,肺功能下降速度不同等个体差异性,这种情况下使用动物模型研究COPD加重的特殊性进行分析面临诸多问题。在临床研究中,识别出易急性加重的COPD患者,阐明并鉴定COPD特定临床表型相关性和患者病情加重的潜在机制是COPD动物实验研究中的重要部分。然而,由于COPD病程呈慢性迁延,急性加重后疾病的预后也有差异,但在动物模型中我们通常使用横断面研究,终点事件出现后一般不再进行长时间跟踪观察,这对动物实验产生的结果应用于人类面临很多不确定性,动物模型的评估效用也面临挑战。参考文献陈美凤,加慧,夏书月.不同COPD动物模型特点及应用的研究进展[J].中国实验动物学报,,28(4):~.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
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